La Oficina Internacional de Epizootias OIE tiene disponible en su página un manual de diagnóstico de gran número de enfermedades de los animales. La versión íntegra del manual está en inglés. En español sólo aparecen algunas secciones. La parte correspondiente a la EEB está sólo en inglés, aunque en la página advierten que está en marcha una traducción al español.
Nosotros nos hemos adelantado. Os presentamos aquí una traducción íntegra de la parte del manual correspondiente a la EEB para que esa información sea accesible a un mayor número de personas.
Manual de normas de la Oficina Internacional de Epizootias
para pruebas de diagnóstico y vacunas
CAPÍTULO 3.2.13.
ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA
RESUMEN La encefalopatía espongiforme bovina (EEB) es una enfermedad neurológica fatal del bovino adulto, reconocida por primera vez en Gran Bretaña (GB) en el año 1986. Las alteraciones patológicas, el patrón epidemiológico y la transmisibilidad de la enfermedad indican que la EEB es una de las encefalopatías espongiformes subagudas originadas por agentes transmisibles no convencionales o priones. El modelo para este grupo de enfermedades es el scrapie (prurigo lumbar) de ovinos y caprinos (ver el Capítulo X.9. Scrapie).
La actual epizootia de EEB puede explicarse por la exposición oral a un agente de tipo scrapie, presente en la proteína de los concentrados comerciales o suplementos alimenticios de harinas de carne y hueso derivadas de rumiantes. Se considera que, al menos, los primeros casos de EEB en otros países fueron el resultado de exportaciones desde GB de ganado infectado o harinas de carne y hueso contaminadas. La prohibición de alimentar a los rumiantes con proteínas procedentes de rumiantes entró en vigor por primera vez en GB en julio de 1988. Desde entonces, la inclusión de proteínas de mamíferos en la alimentación de los rumiantes ha sido, con ciertas exenciones, prohibida en toda la Unión Europea y algún otro país. Esta prohibición sobre las harinas de carne y hueso de mamíferos se amplió, en abril de 1996, a todos los animales de abasto en el Reino Unido (UK). Se ha demostrado la transmisibilidad experimental de la EEB al bovino a través de la vía oral y parenteral, a partir de tejido cerebral de bovinos infectados. Los estudios epidemiológicos en GB demostraron que la descendencia de las madres que habían padecido la enfermedad clínica tenía un mayor riesgo de desarrollar la EEB, aunque este mayor riesgo no mantendría la enfermedad endémica en la cabaña de ganado autóctono. Como consecuencia de las medidas de control aplicadas, la epizootia está disminuyendo en el Reino Unido y en Suiza.
Se cree que el agente causal de la EEB es también el responsable de encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) en varias especies de bóvidos y félidos. Hay pruebas que relacionan al agente causal de la EEB con el de una nueva variante de una EET humana, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ).
La EEB, tal como se desarrolla en GB, muestra su mayor incidencia en el bovino comprendido entre los 4 y 5 años de edad. El curso clínico es variable y puede durar varios meses. Los signos clínicos son lo suficientemente distintivos como para hacer sospechar la enfermedad, en particular si se excluyen otras causas por diagnóstico diferencial. En los países con una normativa específica sobre la enfermedad, los bovinos clínicamente sospechosos se sacrifican obligatoriamente, se analiza el encéfalo y se destruyen los animales positivos. Las recomendaciones concernientes a la seguridad en el manejo de material infectado con EEB consideran actualmente que la EEB es una zoonosis y ha sido incluida en la categoría de contención 3 (con derogación).
Identificación del agente causal: No existe, por el momento, ninguna prueba diagnóstica para la demostración del agente de la EEB en el animal vivo. Una proteína específica de la enfermedad, PrPsc, que es una isoforma de una proteína de membrana, PrP, tiene una importancia crítica en la patogénesis de estas enfermedades, y según la hipótesis del prión es el único componente del agente causal.
Para confirmar el diagnóstico de encefalopatía espongiforme es necesario el examen histopatológico del encéfalo. La correlación entre el diagnóstico clínico y el neurohistológico, con la adecuada experiencia, puede llegar a ser mayor del 90%. El examen histopatológico puede proporcionar también un diagnóstico diferencial en casos clínicos sospechosos en los que no se detecten lesiones de EEB. La lesión patognomónica la constituye el cambio espongiforme en el neuropilo de la sustancia gris y la vacuolización neuronal de ciertos núcleos del tronco del encéfalo. Este cambio es generalmente, pero no siempre, simétrico de forma bilateral. La detección por medios inmunoquímicos de la acumulación de PrPSc en el sistema nervioso central del bovino afectado, permite un diagnóstico específico de la enfermedad. La PrPSc se puede detectar en extractos de tejido encefálico sin fijar por medio del inmunoblotting u otros métodos inmunoenzimáticos. La demostración por inmunohistoquímica de los patrones característicos de acumulación de PrP en encéfalos afectados, fijados con formalina, se emplea con profusión en la actualidad como método de confirmación del diagnóstico. Las fibrillas características, homólogas de las asociadas al scrapie y formadas por PrPSc, se pueden poner de manifiesto por microscopía electrónica sobre extractos de encéfalos afectados por la EEB, tratados con detergente, sin fijar (o fijados con formalina) y se han utilizado también para confirmar el diagnóstico.
La EEB se puede transmitir, a partir de tejido encefálico de bovinos afectados en estado terminal, al ratón por inoculación intracerebral/intraperitoneal o por la alimentación, pero el periodo de incubación, de varios meses, impide el empleo del bioensayo como método de rutina. Es el único método práctico disponible actualmente para detectar la infectividad.
Tests serológicos: no se ha detectado ninguna respuesta inmune en el scrapie o en otras EETs.
Requerimientos para vacunas y productos biológicos de diagnóstico: no existen productos biológicos disponibles actualmente.
A. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Ya había aparecido previamente una descripción detallada en inglés francés y español (30) de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) su transmisibilidad experimental (16, 21), presentación, epidemiología, signos clínicos, lesiones, diagnóstico, prevención y control. Las revisiones más recientes han aportado información actualizada (13, 14, 35).
La EEB es una enfermedad inevitablemente fatal del bovino doméstico, cuyos primeros casos se reconocieron en Gran Bretaña (GB) en noviembre de 1986 (58). Es una enfermedad que se incluye dentro del grupo de las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) o enfermedades priónicas, cuyo paradigma en los animales lo constituye el scrapie (prurigo lumbar) de los ovinos. Lo que define a estas enfermedades es el acúmulo patológico, principalmente en el sistema nervioso central, pero también en el tejido reticular linfoide, de una isoforma anormal de una proteína propia del hospedador, denominada PrP. Los estudios retrospectivos indican que el primer caso de EEB habría aparecido en torno a abril de 1985. Los estudios epidemiológicos iniciales establecieron que la EEB se presentaba como una epizootia extendida, con un origen común en una infección de origen alimentario por un agente de tipo scrapie presente en harinas de carne y hueso empleadas como suplemento proteico de la dieta.
La EEB ha aparecido en otros países aparte del Reino Unido (RU) afectando a animales importados o nativos. El origen de estos casos se debió, probablemente, de forma directa o indirecta, a la exportación de ganado o de harinas de carne y hueso infectados, desde países con presencia de EEB, incluido el RU en el pasado. No está claro si la infección se extendió después en todos los países en los que han aparecido casos. Se han registrado casos en poblaciones de ganado nativo fuera del RU en Bélgica, Dinamarca, Francia, Irlanda, Liechtenstein, Luxemburgo, Países Bajos, Portugal y Suiza.
Desde julio de 1988 en GB y enero de 1989 en Irlanda del Norte, se prohibieron las proteínas de origen rumiante en la alimentación de los rumiantes. Con algunas excepciones, se ha prohibido en otros lugares, desde entonces, el empleo de proteínas derivadas de mamíferos en la alimentación de los rumiantes; en Suiza (diciembre de 1990) (52) y a lo largo de toda la Unión Europea (junio de 1994) (35). Desde abril de 1996 esta prohibición, al menos cuando la proteína se presenta en la forma de harinas de carne y hueso, se extendió en el RU a todos los animales de abasto, incluidos caballos y acuicultura. Se ha demostrado experimentalmente que la EEB se puede transmitir en el bovino tras la exposición a tejido cerebral procedente de bovinos afectados, siguiendo la vía parenteral u oral (16, 56). Los estudios epidemiológicos en GB han demostrado un mayor riesgo de que la descendencia de los casos clínicos de EEB desarrolle también la enfermedad (63). No se ha demostrado si esto se debe a una verdadera transmisión maternal. Se piensa que este mayor riesgo no ocasionará el mantenimiento de la enfermedad como endémica en la cabaña nacional del RU. No hay evidencia de una transmisión horizontal de la enfermedad entre los bovinos. Los estudios epidemiológicos y sobre la transmisión, no han demostrado la existencia de riesgos a partir del semen (65) o la leche (33, 51). Aunque los estudios experimentales no estarán completos hasta 2001, tampoco hay evidencias de la transmisión de la EEB a través de los embriones (65). Como consecuencia de las medidas de control, la epizootia en el RU y en Suiza está disminuyendo.
Como consecuencia de la novedosa aparición de casos de EET en varias especies de bóvidos y félidos salvajes en cautividad y en gatos domésticos, durante la epizootia de EEB, se sospechó o, en algunos casos, se confirmó que se debía al agente de la EEB. Se supone que la exposición se produjo por medio de la alimentación.
En el pasado los estudios epidemiológicos no habían demostrado ninguna relación entre la exposición de los humanos a los agentes causantes de encefalopatías espongiformes animales y la aparición de casos de la EET humana denominada enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ). No se había establecido ningún aumento de riesgo, de tipo ocupacional o alimentario, relacionado con la exposición a los productos del ovino, sugiriendo así que los agentes del scrapie no constituían un peligro para la salud humana en las condiciones naturales de exposición. Sin embargo, la monitorización de los casos de ECJ en el RU dio lugar, en marzo de 1996, al anuncio del descubrimiento de 10 casos de lo que aparentemente era una nueva variante de la ECJ esporádica (ECJ-v) (64). Por julio de 2000, se habían registrado 76 casos de ECJ-v en el RU. En Francia se había comunicado al menos un caso (12) y otro en Irlanda. Los estudios en ratones (10, 47), de tipificación de la variante del agente causal de la ECJ-v, han proporcionado una sólida evidencia de que la misma variante del agente derivado de la EEB se encuentra también en la ECJ-v. Los estudios que muestran las similitudes entre manchas de Western blots y patrones de glicoxilación de la isoforma de PrP relacionada con la enfermedad, procedentes de pacientes con ECJ-v y los procedentes de ciertas especies animales con EEB transmitida experimentalmente o adquirida de forma natural, apoyan también esta conclusión. Por lo tanto, basándose en estas pruebas, la explicación más probable para los casos de la ECJ-v es la exposición al agente de la EEB. Como no se conoce el periodo de incubación de la ECJ-v es muy pronto para predecir el curso de la epidemia. La incidencia actual de la enfermedad debe ser contemplada aún con cautela. Por lo tanto, actualmente, se recomienda que las medidas de precaución para manejar el agente de la EEB se basen en la consideración de que la EEB es transmisible a la especie humana. Se le ha asignado categoría de contención 3 (con derogación) (37).
La EEB afecta al bovino adulto desde aproximadamente los 2 años de edad, pero la mayoría de los casos se dan en animales de 4 a 5 años. No hay predilección de raza, pero sí, dependiendo de la orientación productiva, una incidencia mucho mayor en los rebaños lecheros que en los de carne, ya que en el Reino Unido fueron principalmente las crías de los hatos lecheros las que fueron alimentadas con raciones de concentrados que contenían harinas de carne y hueso. El comienzo de los signos clínicos no se asocia con pautas estacionales o de estadios del ciclo de crianza.
La EEB tiene un comienzo insidioso y generalmente un curso lento y progresivo (8, 30, 58, 62). Rara vez se presentará un caso con signos agudos y rápido deterioro (62). Los síntomas observados, aunque variables, incluyen generalmente cambios del comportamiento, aprensión e hiper-reacción. Por ejemplo, las vacas afectadas pueden mostrarse remisas a entrar en la sala de ordeño o cocear vigorosamente durante el ordeño. Especialmente en vacas secas, los primeros síntomas que se aprecien pueden ser incoordinación y debilidad de los miembros pelvianos. A lo largo del curso de la enfermedad predominan los signos neurológicos y pueden incluir muchos aspectos de un estado mental alterado, anormalidades del comportamiento, la postura, el movimiento y sensaciones aberrantes, pero los signos clínicos observados con más frecuencia son aprensión, ataxia del tercio posterior e hiperestesia al tacto y al sonido. El intenso prurito característico de algunos casos de ovinos con scrapie no resulta prominente en el vacuno con EEB, aunque en algunos casos se presentan actividades de frote y rascado. Las vacas afectadas aparecen a veces con la cabeza baja, el cuello extendido y las orejas dirigidas hacia atrás (53). Las anormalidades de la marcha incluyen balanceo del cuarto trasero e hipermetría de los miembros pelvianos, que se aprecian más fácilmente cuando las vacas están en el pasto. La ataxia en la marcha puede afectar también a los miembros anteriores y al avanzar la gravedad de los signos locomotores, la debilidad general que ocasiona caídas y que el animal no se pueda levantar, puede ser lo más característico del cuadro clínico. Se ha observado disminución de la rumia (2, 4) junto con bradicardia y alteraciones del ritmo cardiaco (3) que, aunque no son signos específicos, sugieren que en la EEB también resulta alterado el sistema nervioso autónomo. Los síntomas generales de pérdida de condición corporal, disminución de peso y reducción de la producción lechera, acompañan a menudo a los signos nerviosos a medida que la enfermedad progresa. No ha habido ningún cambio en el cuadro clínico de la EEB a lo largo de la epizootia del Reino Unido (61). Los signos clínicos son esencialmente similares en otros países donde ha aparecido la EEB (8). El prolongado curso clínico, que se extiende a lo largo de semanas o meses, suele requerir el sacrificio por consideraciones humanitarias. Sin embargo una política normativa para determinar el status de un país respecto a la EEB, requiere la notificación obligatoria y la investigación diagnóstica de los casos clínicos sospechosos, su sacrificio y la completa destrucción de los cadáveres de los afectados (36). Al comienzo del curso clínico los signos pueden ser poco llamativos, variables e inespecíficos, dificultando de este modo un diagnóstico clínico en un primer examen. La observación continuada de estos casos confusos, junto con los procedimientos clínicos apropiados para descartar otros procesos por diagnóstico diferencial, especialmente los desórdenes metabólicos, mostrará finalmente el típico patrón de signos progresivos de la enfermedad. Algunos síntomas del comienzo de la enfermedad pueden mostrar similitud con los de la cetosis nerviosa, hipomagnesemia, listeriosis cerebral y otras encefalitis. Los signos poco llamativos, pueden exacerbarse a veces tras una situación de estrés, como la ocasionada por el transporte.
Debido a la conexión recientemente establecida entre la EEB y la ECJ-v, se categoriza ahora a la EEB y los agentes de EET relacionados, con respecto a su biopeligrosidad, junto con los de EET humana (1). Consecuentemente, los veterinarios y los trabajadores de laboratorio que realicen necropsias de animales sospechosos de EEB o manejen tejidos procedentes de esos animales, deben realizar su trabajo con las condiciones de protección adecuadas (categoría 3) (37), a veces con derogaciones permitidas por la naturaleza del trabajo y los resultados de la valoración local del riesgo. Es importante que se vista la indumentaria de protección adecuada y que se siga un estricto código de prácticas para prevenir la exposición al agente. Los laboratorios que trabajen con EEB deben cumplir la normativa nacional sobre bioprotección y bioseguridad. Los procedimientos recomendados de descontaminación puede que no sean completamente efectivos cuando se trata de materiales con un título infeccioso elevado o cuando el agente se encuentra protegido por materia orgánica seca. La inactivación física que se recomienda se lleva a cabo por pasada en autoclave para materiales porosos a 134ºC-138ºC durante 18 minutos a 30 libras/pulgada2. Sin embargo, las temperaturas en el extremo superior del rango puede que sean menos efectivas que las del extremo inferior y la inactivación total puede que no se logre bajo ciertas condiciones, como las que ocurren cuando el material está en forma de macerado (50). La desinfección se realiza con hipoclorito sódico con el 2% de cloro disponible o con hidróxido sódico 2N, aplicado durante más de 1 hora a 20ºC para las superficies o durante toda la noche para el material.
1. Identificación del agente La naturaleza de los agentes responsables de las EETs humanas o animales no está clara aún (42). La forma modificada (PrPSc) de una proteína de membrana del hospedador (PrPC), altamente conservada a lo largo de la escala evolutiva y de función desconocida, es la única macromolécula específica de la enfermedad, identificada en las enfermedades de tipo scrapie. Una importante corriente científica es la que sostiene que el agente está formado únicamente por la isoforma de la PrP específica de la enfermedad y que la forma alterada es capaz de inducir la conversión de la forma normal; hipótesis solamente proteica o ‘priónica’. La corriente opuesta sostiene que el agente es del tipo de los virus y contiene ácido nucleico. La identificación de múltiples ‘cepas’ de agentes del scrapie, con periodos de incubación y modificaciones neuroanatómicas características cuando se transmiten al ratón, se considera que están más de acuerdo con esta última hipótesis. Sin embargo resulta difícil compaginar esta concepción con la extrema resistencia del agente a los procedimientos de inactivación microbiana incluyendo las radiaciones ultravioleta e ionizantes, temperaturas extremas, procedimientos estándar de autoclave y una larga lista de desinfectantes químicos. La base molecular de la variación de las distintas cepas no esta clara aún.
La tipificación del agente por transmisión de la EEB al ratón ha demostrado que la EEB es producida por una única y principal cepa, diferente de las tipificadas en el scrapie del ovino (9). La uniformidad de las manifestaciones patológicas en los bovinos afectados ha apoyado también la idea de una única cepa de EEB y permitido la definición de un fenotipo de enfermedad propio de la EEB (57). Este patrón neuropatológico específico en las especies sensibles, es una característica importante para la definición de caso de EEB.
Ante la falta de métodos para el aislamiento in vitro del agente causal, la confirmación del diagnóstico en este grupo de enfermedades se basa, de forma convencional, en la demostración de las características morfológicas de la encefalopatía espongiforme mediante el examen histopatológico. Algo que continúa siendo necesariamente, por definición, el único método por el que se puede diagnosticar esta patología vacuolar característica. Sin embargo, teniendo en cuenta el papel principal que desempeña la molécula de PrPSc y el aumento de la capacidad técnica en este campo, resulta importante en la actualidad que los enfoques diagnósticos que se adopten, empleen uno o más métodos para la detección de la forma anormal de proteína. La demostración por microscopía electrónica, en extractos de sistema nervioso central, de fibrillas características, denominadas fibrillas asociadas al scrapie (SAF) (scrapie-associated fibrils) compuestas en gran medida de PrPSc, representa un método de diagnóstico morfológico adicional. Los métodos para la detección de PrPSc incluyen la demostración inmunohistoquímica, el Western blotting y, más recientemente, cierto número de otros inmunoensayos rápidos para el chequeo de poblaciones. El empleo de uno u otro método dependerá del propósito para el que se emplee el diagnóstico en un contexto epidemiológico determinado. El rango de posibles propósitos se extenderá desde la confirmación del diagnóstico clínico en el control de la enfermedad epizoótica, hasta el chequeo de poblaciones sanas en busca de casos enmascarados o preclínicos. La definición de caso que se adopte será distinta también, según que el método vaya a ser aplicado para la confirmación de un caso o para el chequeo de una población. Para el primero es importante adoptar enfoques que permitan observar el fenotipo patológico de la EEB. Resulta también evidente que el rendimiento de cada método en concreto, será crucial en este proceso de selección de un único método o un enfoque conjunto. Debe resaltarse que se observa una rápida evolución en el campo del desarrollo de métodos, particularmente en los de inmunoensayo rápidos para chequeo, basados en la detección de PrPSc.
La definición inicial de caso de EEB se basó en las alteraciones histopatológicas del sistema nervioso central y es lo que ha proporcionado la base habitual para la confirmación del diagnóstico clínico de EEB (54, 58). El examen histopatológico permite también la confirmación del fenotipo neuropatológico característico de la EEB (48, 60). Los cambios histopatológicos son de carácter neurodegenerativo y recuerdan fielmente a los del scrapie de las ovejas. Los rasgos más prominentes son los vacuolares y comprenden un cambio espongiforme en el neuropilo de la sustancia gris y una única o múltiples vacuolas dentro del pericarion neuronal. La apariencia concreta de la alteración espongiforme en las encefalopatías transmisibles, según se observa al microscopio óptico, ha sido definida previamente (31). En la EEB el cambio vacuolar predominante es el espongiforme. Ambas formas de vacuolización son bilaterales y generalmente simétricas, con un patrón de severidad consistente por su distribución por todo el encéfalo (55, 60). La alta frecuencia con que se observa la vacuolización neuroparenquimal en ciertos núcleos anatómicos de la médula oblonga (bulbo raquídeo), al nivel del óbex, proporcionó, en la epidemia de EEB del Reino Unido, un medio satisfactorio para establecer un diagnóstico a partir de una sola sección del bulbo (54). Sin embargo, la observación de lesiones no concluyentes en este nivel del bulbo requiere el análisis de otras áreas encefálicas para detectar los casos de EEB con lesiones mínimas o potencialmente atípicas y, cuando sea necesario, para establecer diagnósticos diferenciales. En la EEB no son prominentes otras alteraciones neurodegenerativas aparte de la vacuolización. Otra característica es una gliosis (astrocitosis), como aparece en el scrapie, particularmente en los lugares de degeneración vacuolar. La detección de la gliosis se favorece por el empleo de tinciones especiales y de la inmunohistoquímica. Por ejemplo, se puede demostrar la astrocitosis por detección inmunoquímica del aumento de proteína acídica glial (GFAP).
En la preparación del material para el examen histopatológico, el ganado sospechoso de padecer la enfermedad debe ser sacrificado mediante inyección intravenosa de una solución concentrada de un barbitúrico, tras una sedación si fuera necesario. Los procedimientos técnicos referidos a la recogida de la muestra, fijación y procesado histológico, han sido descritos (7, 44) y se revisan y resumen más abajo.
En cualquier situación de vigilancia de enfermedad neurológica en el bovino adulto, donde la presencia de EEB en un país o región no se ha establecido o es de baja incidencia, es importante que se adopte un enfoque neuropatológico normalizado, en el que se examinen áreas representativas de la totalidad del encéfalo. Esto depende de las circunstancias nacionales locales, incluyendo si se necesita o no un diagnóstico diferencial.
El tejido encefálico se debe extraer tan pronto como sea posible tras la muerte. El material fresco susceptible de ser usado en tests para detectar la PrP específica de la enfermedad debe ser tomado, de forma ideal, como una sección coronal completa (2-4 g) de la médula oblonga, caudal al óbex, evitando especialmente dañar la región del óbex. La médula espinal cervical y el hemisferio lateral del cerebelo también constituyen áreas óptimas para el muestreo que no interfieren con las áreas necesarias para el examen histopatológico. Este tejido se almacena congelado antes de realizar el test. Si lo que resta del encéfalo se muestrea para el examen histopatológico, se debe colocar en unos 4-6 litros de solución salina fijadora de formol al 10%, que debe cambiarse dos veces por semana. Tras la fijación durante dos semanas, se corta el encéfalo en rebanadas coronales. El tiempo de fijación se puede reducir cortando el tronco del encéfalo fresco en pequeñas piezas coronales, dejando intactas las importantes áreas para el diagnóstico, del óbex, los pedúnculos cerebelares y los colículos rostrales. Dependiendo de otros factores (temperatura, agitación, uso de microondas) el tiempo de fijación para estas pequeñas piezas de tronco del encéfalo se puede reducir a 2-5 días. Las otras partes del encéfalo fijadas en formol se pueden utilizar para diagnósticos diferenciales tras completar las dos semanas de fijación estándar. Inicialmente solo se debe seleccionar un único bloque cortado al nivel del óbex de la médula oblonga (Figura 1) para el procesado histológico por métodos convencionales de inclusión en parafina. Se examinan cortes de 5 µm de espesor, teñidos con hematoxilina y eosina, en busca de la característica lesión espongiforme y la vacuolización neuronal. Si los resultados no son concluyentes debido a que las lesiones son mínimas o a que el material es histológicamente ininterpretable por la autolisis u otros daños, es preciso llevar a cabo pruebas adicionales, incluyendo la inmunohistoquímica o el inmunoblotting. Cuando ha sido establecida la presencia de EEB en el ganado nativo de un determinado país y se ha evidenciado que la distribución de las lesiones es concordante con la observada en los encéfalos de bovinos de la epizootia del RU, resulta adecuado para la vigilancia extraer solo la parte posterior del encéfalo (Figura 1). Esto se puede lograr a través del agujero magno, lo que reducirá la cantidad necesaria de fijador, reduciendo, de este modo, costes y mejorando la seguridad al mismo tiempo que se mantiene la representatividad de las mejores áreas para el examen histológico. Se puede confirmar el diagnóstico si aparecen completamente los cambios típicos en la sección de la médula oblonga (óbex). Cuando las lesiones no son evidentes en la médula oblonga (óbex), se deben examinar otras partes del tronco cerebral (Figura 1). Sin embargo, dada la constancia del patrón lesional, es improbable que contribuya a una confirmación adicional en más de un 0,5% de los casos de EEB en que las lesiones no estén presentes en la sección de médula oblonga (óbex) (54). Es evidente que este protocolo abreviado no permite un examen neuropatológico completo para establecer diagnósticos diferenciales.
Fig. 1. Tronco del encéfalo tras la eliminación del cerebelo, vista dorsal a) y lateral b).
Niveles recomendados donde se deben tomar las secciones:
A-A = médula oblonga en el óbex;
B-B = médula oblonga al nivel de los pedúnculos cerebelares caudales; C-C = mesencéfalo al nivel de los colículos rostrales.
La interpretación de las alteraciones vacuolares en el encéfalo bovino debe hacerse con cuidado. Se ha comunicado la observación de vacuolas en el pericarion, indistinguibles de las de la EEB en neuronas de los núcleos rojo y oculomotor del mesencéfalo y otros núcleos del tronco encefálico como un hallazgo ocasional en el bovino (19, 32, 58). Así, al igual que en el diagnóstico del scrapie, que puede ser confundido por la aparición de esa vacuolización neuronal diseminada por la médula del ovino sano (ver el Capítulo X. Scrapie) (66, 67), el diagnóstico histopatológico de la EEB no debe basarse en la presencia ocasional de neuronas vacuolizadas solitarias. Incluso neuronas vacuolizadas relativamente numerosas en el núcleo rojo deben ser ignoradas. Para minimizar la posibilidad de diagnosticar falsos positivos en la EEB, lo que mayor confianza proporciona es la observación del cambio espongiforme en determinadas localizaciones neuroanatómicas.
Al igual que en el scrapie del ovino, la posibilidad de la existencia casos de EEB con lesiones encefálicas mínimas o no detectables por microscopía óptica, es un problema potencial que solo puede ser resuelto por criterios diagnósticos independientes de la histopatología (44, 59).
Para el diagnóstico de rutina en países con alta incidencia de EEB, el método laboratorial empleado para manejar el gran número de casos sospechosos es el examen histopatológico, restringido a la médula oblonga. La demostración de las alteraciones típicas proporciona un diagnóstico definitivo. Cuando el resultado del examen histopatológico no es concluyente o negativo o el material encefálico extraído post mortem no es adecuado para el examen histopatológico debido a la autolisis o a que está dañado, es importante que se aplique como criterio de diagnóstico específico de la enfermedad, la detección de la acumulación anormal de PrP. Resulta también de mayor importancia cada vez, que se apliquen tales tests en la fase de disminución de la epizootia y en los programas de vigilancia en los que se requiera la monitorización más crítica de la enfermedad. Las autoridades nacionales en particular, deberían establecer el empleo de métodos de diagnóstico laboratorial adicionales, como el inmunoblotting, la inmunohistoquímica (IHQ) o la detección de las fibrillas asociadas al scrapie, cuando su uso se considere procedente.
En conjunción con, o incluso como una alternativa a la histopatología de las secciones de médula oblonga, se encuentra el empleo de la IHQ para detectar los acúmulos de PrPSc en material fijado con formalina e incluido en parafina (24, 60). Se han aplicado exitosamente, a la detección de PrP por IHQ, varios protocolos diferentes para el diagnóstico de la EEB (22, 24, 29, 60). Todavía es necesaria una armonización dirigida a validar completamente un método de diagnóstico de rutina estandarizado de IHQ. La técnica tiene mayor sensibilidad que la histopatología convencional, ya que puede detectar casos en los últimos meses del periodo de incubación, antes de que se produzcan las alteraciones vacuolares, al menos en los casos de EEB inducidos experimentalmente (56) y posiblemente también en la enfermedad natural (18). Por lo tanto la EEB se puede diagnosticar por IHQ en animales con alteraciones morfológicas confusas. No requiere largos periodos de fijación del tejido y, siempre que el tejido se pueda procesar histológicamente de forma adecuada, la técnica funciona bien en tejidos autolíticos en los que la evaluación morfológica ya no es posible. La IHQ es tan sensible como el Western blotting para la detección de PrPSc (41). En combinación con buenas preparaciones histológicas la IHQ permite la detección de la acumulación de PrPSc y, como la acumulación de PrPSc, al igual que la patología vacuolar, un típico patrón de distribución y apariencia, proporciona simultáneamente la evaluación o confirmación del fenotipo de la enfermedad. En países con baja incidencia de EEB, la IHQ es, por lo tanto, un método de elección tanto para la confirmación del diagnóstico como para la vigilancia epidemiológica.
Se considera que la detección de PrPSc por inmunohistoquímica es prometedora en el diagnóstico preclínico del scrapie de los ovinos empleando biopsias de tejido linfoide de la membrana nictitante (38) o de tonsilas (43). Al no haberse detectado infectividad en tejidos linfoides, salvo en el ileon distal (que contiene Placas de Peyer) del bovino infectado experimentalmente, en ninguna etapa del periodo de incubación o del curso clínico, parece que es poco probable que actualmente estos procedimientos sean de utilidad en el diagnóstico de la EEB.
La detección de PrPSc por separación electroforética y técnicas de inmunoblotting (20, 26, 49), se realiza en material encefálico o de médula espinal fresco (sin fijar) o congelado. Las mejoras en los métodos de purificación para la extracción de PrP (6, 17) han contribuido a aumentar la sensibilidad de este método. Se han desarrollado técnicas automatizadas de Western blotting y de enzimo-inmunoensayo (ELISA) permitiendo el chequeo de gran número de muestras encefálicas (34, 41). Estas técnicas son fáciles y rápidas de realizar y potencialmente más sensibles que la evaluación histopatológica. En una prueba de la Comisión Europea se demostró que uno de tales métodos de Western inmunoblotting o cualquiera de dos métodos de ELISA específicos que se evaluaron en tejido encefálico, eran adecuados para su uso diagnóstico dirigido a poblaciones. Esta evaluación se restringió a una comparación del examen de una muestra de encéfalos de bovinos identificados como sospechosos por sintomatología clínica, con alteraciones histopatológicas características de la EEB, y una muestra de encéfalos de bovinos de Nueva Zelanda que no habían estados expuestos a la EEB y eran negativos histopatológicamente. La validación de estos tests continúa, pero parece que son fiables para el chequeo a gran escala y los programas de vigilancia. Proporcionan un medio de chequeo inicial de animales en los últimos estadíos (los últimos meses) del periodo de incubación, por ejemplo en análisis post-mortem del material recogido del sacrificio rutinario de bovinos. En países que realicen vigilancia para detectar la aparición inicial de la EEB y en aquellos que consideren necesario un medio para valorar la prevalencia de la EEB, distinto de la notificación de casos sospechosos, estos nuevos tests suponen un medio eficiente.
La demostración de fibrillas características, el equivalente bovino de las SAF (ver el Capítulo X.9. Scrapie), por microscopía electrónica y tinción negativa, en extractos obtenidos con detergente, de tejido fresco o congelado de encéfalo o médula espinal (46, 49, 58), ha sido utilizada como un método adicional de diagnóstico de EEB y puede resultar particularmente útil cuando no es posible emplear la histopatología por haberse producido fenómenos de descomposición post-mortem (45). Trabajos recientes sobre el scrapie indican que, con modificaciones, el método puede ser aplicado con éxito en tejido fijado con formalina (11). Se ha comprobado que la demostración de fibrillas se correlaciona bien con el diagnóstico histopatológico de la EEB (59), pero no ofrece la especificidad o la sensibilidad que proporcionan los métodos histopatológicos o de inmunoblotting. Debe recalcarse que el proceso de la completa validación de todos estos métodos de diagnóstico de la EEB se ha visto frenado por la falta de un verdadero estándar indiscutible y la consiguiente necesidad de aplicar estándares de comparación basados en estudios relativamente pequeños. Existe por lo tanto una necesidad constante de que se publiquen estudios hechos a mayor escala sobre la validez de los métodos. Se debe interpretar con cautela la comparación de métodos aplicados en animales aparentemente sanos, puesto que los diferentes métodos pueden tener diferente sensibilidad en relación con el estadio del periodo de incubación y la patogénesis de la enfermedad.
La infección por EEB se puede demostrar por inoculación intracerebral/intraperitoneal (21) o alimentando (5) ratones con tejido encefálico de bovinos afectados en estado terminal, pero el bioensayo no resulta práctico para el diagnóstico de rutina debido al largo periodo de incubación (292 días). Un mayor desarrollo de los ratones transgénicos puede proporcionar bioensayos con un periodo de incubación de EEB reducidos significativamente.
2. Tests serológicos
Las similitudes con el scrapie, en el que no se ha detectado respuesta inmune alguna en el hospedador, sugieren que no es probable que se produzca una respuesta inmune en la EEB.
3. Otros tests
Sigue existiendo la necesidad de un test para la EEB, que pueda ser aplicado en el animal vivo, con una sensibilidad capaz de detectar PrPSc en los bajos niveles en que puede estar presente en los primeros estadios de la incubación de la enfermedad. Ciertas proteínas marcadoras, especialmente la apolipoproteína E (Apo E), se puede detectar por electroforesis bidimensional en gel a partir del líquido cefaloraquídeo de los casos clínicamente sospechosos, confirmados histopatológicamente (28). La Apo E no es, sin embargo, un marcador específico de neurodegeneración y no se ha demostrado que sea útil en el diagnóstico de casos preclínicos de EEB. El análisis del líquido cefaloraquídeo en busca de la proteína 14-3-3 no es de utilidad diagnóstica en la EEB (40). Igualmente, los estudios sobre las proteínas S-100 en el líquido cefaloraquídeo (23) y en el suero (39) no dieron resultados que pudieran servir para métodos útiles de diagnóstico de EEB. La detección electroquímica de metabolitos en la orina (27) rindió finalmente, en la validación, unos valores de sensibilidad y especificidad por debajo de los requeridos para que se le pueda asignar un posible papel independiente en el diagnóstico de la EEB. B. REQUERIMIENTOS PARA VACUNAS Y PRODUCTOS BIOLÓGICOS DE DIAGNÓSTICO
No existen productos biológicos disponibles actualmente.
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Actualizado: 29/11/2001
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Office International des Epizooties
Traducción: José Díez Vega
Sindicato de Veterinarios de León. Diciembre de 2001.
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