ENZIMO-INMUNO-ELECTROBLOTTING (IEB O WESTERNBLOTTING)

La razón para transferir proteínas desde geles a membranas es para hacerlas más accesibles a distintas pruebas, ya que la poliacrilamida no es muy adecuada para la difusión de grandes moléculas. El tipo más común de prueba al que se someten esas proteínas inmovilizadas es un anticuerpo y el complejo antígeno-anticuerpo se visualiza por enzimoinmunoensayo indirecto usando un sustrato cromogénico que genera un producto insoluble. Últimamente se ha empezado a usar la quimioluminiscencia por su mayor sensibilidad de detección. Otras posibilidades son los marcadores fluorescentes o los radioisótopos.
El interés de la técnica radica en la detección de una proteína específica simultáneamente por su antigenicidad y su masa molecular: se separan primero las proteínas por su masa en la electroforesis y luego se detectan específicamente en el inmunoensayo.

A continuación se describe un procedimiento de blotting de geles de poliacrilamida y posterior detección de proteínas usando antisuero de conejo y un conjugado de fosfatasa alcalina con IgG de cabra anti conejo usando para la detección sales de Nitro-azul tetrazolio (NBT ) y bromo-cloro indolil sulfato (BCIP).

Materiales:

Papel de nitrocelulosa, papel de filtro o preferiblemente papel de blotting, cortados del tamaño adecuado usando una cuchilla limpia y guantes.
Electrodos de blotting, que son bloques de carbón de 15 x 20 cm. y 1 cm. de espesor, con gruesos terminales de conexión incrustados.
Fuente de alimentación, normalmente de un alto amperaje y bajo voltaje, debe ser capaz de suministrar de 500 mA a 1 A de corriente a voltajes tan bajos como 5 V.
Buffer para el blotting: puede ser simplemente buffer de electroforesis de Laemmli (Tris -HCL 50mM, glicina 0.196 M, pH 8,3 con 20% de metanol añadido)
Es conveniente que el pH esté por encima de 7 para asegurarse de que todas las proteínas migren hacia el ánodo. El metanol es necesario para evitar el hinchamiento del gel con el calentamiento y para mantener las proteínas adsorbidas a la membrana.

Blotting:

Recién hecha la electroforesis del gel, se sumerge éste en el buffer de transferencia y luego se extiende sobre papel de nitrocelulosa previamente humedecido con el buffer, colocado sobre 3 capas de papel de filtro humedecido con el buffer, colocándolo todo sobre el ánodo (electrodo positivo). Sobre el gel se colocan 3 capas de papel de filtro humedecido y luego el cátodo (electrodo negativo). Se debe tener cuidado de eliminar posibles burbujas que se formen entre el gel y la nitrocelulosa o entre la nitrocelulosa y el papel. Luego el conjunto se coloca en una bandeja de plástico, descansando sobre el ánodo. El ánodo (electrodo del lado de la nitrocelulosa se conecta al ánodo, o conector rojo y el cátodo (lado del gel) se conecta al cátodo o conector negro de la fuente de alimentación y se deja pasar la corriente durante 20-30 minutos para efectuar la transferencia. Una hora debería ser suficiente para una transferencia total.

No se puede tocar el conjunto mientras está conectado a la corriente.

Luego se desmonta el conjunto y se enjuaga la membrana en solución salina u otro buffer antes de continuar.

Procedimiento del enzimo-inmuno-ensayo indirecto

• Bloqueo: Tras aclarar brevemente la membrana del blotting, se sumerge en el buffer de bloqueo durante una hora a 37 ºC o dos horas a temperatura ambiente. Esto sirve para saturar todos los sitios de ligamiento inespecífico de proteínas en los blots. El buffer de bloqueo contiene una solución concentrada de proteínas como por ejemplo 10% de suero fetal de ternero o 5% de leche en polvo desnatada, con Tris-Cl, NaCl y Tween-20, pH 7,4.
• Ligamiento de anticuerpos específicos a las proteínas: se logra por incubación de los blots con antisuero de conejo diluido 1/10 - 1/1000 en el buffer anterior en recipientes cerrados durante una hora en un baño con agitación a temperatura ambiente (22ºC).
• Lavado: con agitación en un buffer de lavado, que puede ser simplemente solución salina con 0,05% de Tween-20, durante 3 a 5 minutos.
• Prueba del ligamiento de los anticuerpos: con el complejo fosfatasa alcalina-inmunoglobulina de cabra anti-inmunoglobulina de conejo. Las condiciones de incubación y de lavado son las mismas que cuando se añadió el antisuero de conejo.
  El ligamiento de los anticuerpos se visualiza por la reacción de la mezcla del NBT y BCIP incubado en la oscuridad. La reacción puede llevar varias horas, pero normalmente se completa en 30-60 minutos. Se termina lavando con agua y los blots se secan bajo papel de filtro y se guardan en la oscuridad. Los resultados se pueden grabar fotográficamente usando un filtro rojo para el blanco y negro o sin filtro para diapositivas en color.

Far western blotting: es similar al western blotting pero usando una proteína marcada como prueba de interacción específica proteína-proteína.

Tomado de: ENZYME-ASSISTED IMMUNOELECTROBLOTTING (IEB OR WESTERN BLOTTING) E.P. Rybicki and Maud Purves. Department of Microbiology University of Cape Town, 1996 http://www.uct.ac.za/microbiology/western.html