Diagnóstico de la influenza aviar

1.Identificación del virus

Las muestras de aves muertas deberían incluir contenido intestinal (heces) o escobillados de cloaca y orofaringe realizados con isopos de toma de muestras. Las muestras de tráquea, pulmones, sacos aéreos, intestino, bazo, riñón, cerebro, hígado y corazón pueden ser tomadas y procesadas por separado o como una masa común.

Las muestras de aves vivas deberían incluir escobillados tanto de tráquea como de cloaca aunque es en los de esta última en los que con más probabilidad se demostrará la presencia de virus. Dado que las aves más pequeñas o delicadas pueden sufrir daños al realizar los escobillados, se puede utilizar como alternativa simplemente la recogida de heces frescas. Se debe procesar al menos un gramo de heces, como tales heces o como recubrimiento de los hisopos.

Se deben colocar las muestras en solución salina isotónica buffer fosfato, pH 7.0-7.4 con antibióticos, ej.  penicilina (2000 unidades/ml), streptomicina (2 mg/ml), gentamicina (50 µg/ml) y micostatina (1000 unidades/ml) para tejidos y escobillados de tráquea pero a una concentración 5 veces mayor para las heces y escobillados de cloaca y es importante reajustar el pH de la solución a  7.0-7.4 tras añadir los antibióticos.

El método preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculación en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o huevos negativos a anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 días de incubación y se incuba a 35-37ºC durante 4-7 días. Luego los huevos con embriones muertos, cuando esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubación se refrigeran a 4ºC y el líquido alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinación. Si se detecta actividad de hemoaglutinatión hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reacción negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos.

La presencia de virus de la influenza A se puede confirmar por medio de la inmunodifusión en gel de agar para demostrar la presencia de antígenos de la nucleocápsida o de la matriz, que son comunes a todos los virus inluenza A.

Se preparan los antígenos concentrando el virus a partir del fluido alantoideo o de la membrana corioalantoidea.

Aparte de la inmunodifusión en gel de agar hay también varios ELISAs disponibles, como kits comerciales, con anticuerpos monoclonales contra la nucleoproteína del virus influenza A.

Cualquier actividad de hemaglutinación de fluidos estériles obtenidos de huevos inoculados se debe con mayor probabilidad a un virus influenza A o a un paramixovirus aviar (unas pocas cepas de reovirus aviares también la producen o fluidos no estériles con actividad de hemaglutinación de origen bacteriano) Actualmente se reconocen 9 serotipos de paramixovirus aviares. La mayoría de los laboratorios tendrán antisueros específicos del virus de la enfermedad de Newcastle (paramyxovirus aviar del tipo 1), y teniendo en cuenta su amplia distribución y su casi universal empleo como vacuna viva en aves, es mejor comprobar su presencia por medio de la prueba de inhibición de la hemaglutinación.

Como alternativa, la presencia de virus influenza se puede confirmar por la reacción de transcripción inversa con la reacción en cadena de la polimerasa empleando iniciadores específicos de la nucleoproteína o de la matriz. También se puede confirmar la presencia del subtipo H5 o H7 mediante el empleo de iniciadores específicos.

El método recomendado para determinar el subtipo utiliza antisueros altamente específicos obtenidos de animales que den un número mínimo de reacciones inespecíficas, como la cabra, dirigidos contra los subtipos H y N.

2. Valoración de la patogenicidad

Se han producido numerosos aislamientos de subtipos   de cepas H5 y H7 de baja patogenicidad, pero todas las cepas altamente patógenas aisladas hasta la fecha tenían la hemaglutinina H5 o H7. Para obtener más información sobre la patogenicidad real o potencial de los subtipos de H5 o H7 aislados se puede recurrir al secuenciado de su genoma ya que la patogenicidad va ligada a la presencia de múltiples aminoácidos básicos (arginina o lisina) en el punto de corte del precursor de la hemaglutinina. Este secuenciado de aminoácidos en los virus influenza H5 o H7 de baja virulencia debería poner de manifiesto a aquellos virus que como el de Pensilvania tenían la capacidad de, tras una simple mutación, convertirse en altamente patógenos para las aves.

El criterio adoptado por la OIE para clasificar a un virus influenza como virus de influenza aviar declarable altamente patógena es el siguiente:

a) Se emplea uno de los dos métodos siguientes para determinar su patogenicidad en pollos. Es un virus de influenza aviar declarable altamente patógena si:

i) Es letal* para 6, 7 u 8 de 8 pollos susceptibles de 4 a 8 semanas de edad en el plazo de 10 días tras la inoculación intravenosa de 0.2 ml de una dilución 1/10 de fluido alantoideo infectivo libre de bacterias.

*Cuando las aves están demasiado enfermas para comer o beber deben someterse a eutanasia.

O

ii) Cualquier virus que tiene un índice de patogenicidad intravenosa mayor de 1.2, siguiendo un procedimiento establecido para determinarlo, que se basa como el anterior en la inoculación en pollos de fluido alantoideo de un determinado título infectivo.

b) Para todos los virus H5 y H7 de baja patogenicidad en pollos se debe determinar la secuencia del péptido de conexión de la hemaglutinina. Si la secuencia es similar a la observada en los altamente patógenos, el virus que se está analizando debe ser considerado también como altamente patógeno.

La OIE también establece el siguiente sistema de clasificación para identificar los virus para los que se requiere una declaración de enfermedad y medidas de control.

a) Todos los virus aislados que cumplan los criterios anteriormente expuestos se consideran virus de influenza aviar declarable altamente patógena. VIADAP

b) Todos los subtipos H5 y H7 no virulentos para el pollo y que en el punto de corte de la hemaglutinina no tienen una secuencia de aminoácidos similar a la de los definidos anteriormente como declarables y altamente patógenos se consideran virus de influenza aviar declarable de baja patogenicidad. VIADBP.

c) Los subtipos que no son H5 o H7 y que no son virulentos para el pollo se clasifican como virus de influenza aviar de baja virulencia. VIABV.

Para el secuenciado del código genético que codifica para la región de corte del precursor de la hemaglutinina de los subtipos H5 y H7 se emplea la transcripción inversa con la reacción en cadena de la polimerasa y varias etapas de este procedimiento se facilitan empleando kits comerciales disponibles y secuenciadores automáticos.

Ahora que ya se ha establecido la presencia de múltiples aminoácidos básicos en la región de corte del precursor de la hemaglutinina, como un indicador fiable de la virulencia o de la potencial virulencia de un virus influenza H5 o H7 parece inevitable que la determinación de la región de corte por secuenciado o por otros métodos se convierta en el método preferido para la valoración inicial de estos virus y su clasificación dentro de las definiciones establecidas más arriba. Esto reducirá también el número de pruebas necesarias in-vivo, aunque por el momento la inoculación a aves puede continuar siendo necesaria para confirmar un resultado negativo ya que la posibilidad de cultivos de virus que contengan una mezcla de poblaciones de virus de alta y baja patogenicidad no puede descartarse.

3. Pruebas serológicas

a) Inmunidifusión en gel de agar

Todos los virus de influenza A tienen antígenos similares de la matriz y la nucleocápsida, lo que hace posible que se pueda demostrar la presencia o ausencia de anticuerpos frente a cualquier virus influenza A por medio de la inmunidifusión en gel de agar. Esta prueba ha sido muy utilizada en diagnósticos de rutina en pollos y pavos como indicador de infección, empleando generalmente preparaciones enriquecidas en antígenos de la nucleocápsida obtenidas a partir de membranas corioalantoideas de huevos embrionados y posteriormente inactivadas. No todas las especies de aves producen anticuerpos precipitantes tras una infección con virus influenza.

b) Hemaglutinación e inhibición de la hemaglutinación

Se considera que los títulos de inhibición de la hemaglutinación son positivos cuando existe inhibición con una dilución del suero problema de 1/16 o mayor cuando es enfrentado con el antígeno a una concentración de 4 HAU (unidades de hemaglutinación).

Existen kits comerciales de ELISA que detectan anticuerpos contra proteínas de la nucleocápsida.

4.Nuevas técnicas para el diagnóstico de la influenza aviar

En la actualidad las técnicas convencionales de aislamiento y caracterización del virus siguen siendo los métodos de elección, al menos para el diagnóstico inicial. Sin embargo los métodos convencionales resultan costosos, laboriosos y lentos. Las nuevas técnicas disponibles son:

Detección del antígeno

El kit commercial disponible Directigen® Flu (Becton Dickinson Microbiology Systems), ha sido empleado para detectar la presencia del virus influenza A en aves, en particular en USA. Emplea un anticuerpo monoclonal contra la nucleoproteína y debería ser capaz, por tanto, de detector cualquier virus influenza A. Aunque fue desarrollado para detectar el virus en infecciones de mamíferos, se ha aplicado con éxito también en aves. Su principal ventaja es que puede demostrar la presencia del virus en 15 minutos. La desventaja es que puede faltarle sensibilidad, no ha sido validado para diferentes especies de aves, no se logra la identificación del subtipo y el kit es caro. Debe ser interpretado como una prueba de rebaño y no como una prueba individual en una sola ave. La mayor sensibilidad se logra con muestras de orofaringe y tráquea de aves afectadas clínicamente o muertas.

Detección directa del ARN

RT-PCR: La Reacción en cadena de la polimerasa para la transcripción inversa, aplicada a las muestras clínicas, podría, con los “primers” adecuados, lograr una rápida detección e identificación del subtipo, al menos de los H5 y H7, y se obtendría un ADN complementario sobre el que podría emplearse la secuenciación de nucleótidos. Se debe tener en cuenta el tipo de muestra clínica empleada, ya que según parece, las muestras traqueales de aves infectadas muestran una gran sensibilidad y especificidad para la detección del virus por RT-PCR, pero con las muestras de heces la sensibilidad sería deficiente. La aplicación práctica de la RT-PCR podría estar en la identificación rápida de brotes subsecuentes una vez que se ha detectado un foco primario y se ha caracterizado el virus. Esta técnica se utilizó con éxito en los brotes de 2003 en Holanda.

Parece muy probable que en poco tiempo la tecnología basada en las pruebas moleculares se desarrolle lo suficiente para permitir la realización de pruebas de rebaño rápidas que permitan detectar la presencia del virus de la influenza aviar, la determinación del subtipo y de indicadores de virulencia. La extensión con que se utilizarán esas pruebas dependerá, en gran medida, del grado de acuerdo que se logre sobre su utilización para definir oficialmente la enfermedad con el objeto de establecer medidas de control y regular el comercio.

Fuente: OIE, http://www.oie.int Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 2.7.12 Avian influenza. Version adopted may 2005

5 El diagnóstico de la influenza aviar en la normativa española

En el REAL DECRETO 1025/1993, DE 25 DE JUNIO de medidas para la lucha contra la influenza aviar, se establecen los “Métodos de diagnóstico para la confirmación y diagnóstico diferencial de la influenza aviar” en su ANEXO III

Gripe aviar