Técnicas de Diagnóstico en las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EETs)

 

 

1. ANTECEDENTES

Las EETs. o enfermedades causadas por priones son procesos neurodegenerativos fatales que afectan a humanos y animales, con la acumulación en el cerebro de una forma anormal, resistente a proteasas, (PrPsc o PrPres) de la proteína priónica normal (PrPc o PrPsen) sensible a las proteasas. Se debate si el agente causal es la PrPsc por sí sola, si hay un componente adicional que porte la información o si hay un agente exógeno desconocido que induzca la configuración anormal de la proteína.

La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJ) es la más común de las EETs humanas. Otras son el síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker y el insomnio familiar fatal (hereditarias) o el Kuru, ligado a prácticas de canibalismo rituales en Nueva Guinea, ya casi erradicado. En países occidentales se han producido infecciones accidentalmente, de origen iatrogénico, por EETs. En 1996 se reconoció una nueva variante de la enfermedad de CJ en el Reino Unido que afectaba a individuos jóvenes, ocasionada previsiblemente por el consumo de alimentos contaminados con el agente causal de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB).

ENFERMEDAD	SÍNTOMAS	FORMA DE CONTAGIO	INCIDENCIA	DURACIÓN DE LA ENFERMEDAD
kuru	Pérdida de coordinación seguida a menudo de demencia	Infección, (probablemente por canibalismo, que cesó en 1958)	Papúa Nueva Guinea: Desde 1957 se han identificado unos 2600 casos	De 3 meses a un año
Enfermedad de Creutzfeldt-Jacob	Demencia seguida de pérdida de coordinación, aunque a veces esa secuencia se invierte	Generalmente se desconoce en la enfermedad esporádica.	1 persona por millón en todo el mundo	Alrededor de un año; puede ir de un mes a 10 años
		En un 10-15% por herencia de una mutación en el gen PrP.	Se ha detectado en unas 100 familias
		Raramente por infección (iatrogénica).	Se han detectado unos 80 casos
Enfermedad de Gerstmann- Sträussler- Scheinker	Pérdida de coordinación seguida de demencia	Herencia de una mutación en el gen PrP	Se han identificado unas 50 familias	De dos a seis años
Insomnio familiar letal	Trastornos del sueño y alteraciones del sistema nervioso autónomo, seguidos de insomnio y demencia	Herencia de una mutación en el gen PrP	Se han identificado 9 familias	Alrededor de un año

El diagnóstico de estas enfermedades abarca una serie de criterios que se solapan aunque ninguno de ellos es suficiente por sí solo. El criterio clínico sirve para el diagnóstico en vida , pero el primordial es el examen neuropatológico del tejido cerebral, ahora ampliado por la inmunodetección de PrPsc. Los síntomas clínicos iniciales son a menudo inespecíficos.

La identificación de PrPsc por tinción inmunológica en tejido linfoide de pacientes con la nueva variante de la enfermedad de CJ (nvCJ) descubrió la posibilidad de que la sangre, componentes de la misma y derivados del plasma usados en medicina, pudieran ser portadores de suficiente infectividad para transmitir la enfermedad entre humanos. Las implicaciones de estos hallazgos junto con el temor a que productos utilizados en medicina, procedentes de animales que pudieran estar incubando la EEB, pudieran constituir un vehículo para la transmisión de la misma a humanos impulsó a investigadores y laboratorios a desarrollar test de diagnóstico sensibles, rápidos y económicos para detectar infecciones y materiales contaminados con agentes de las EETs.

 

2. PRUEBAS DE INFECTIVIDAD

Es el método más exacto de diagnóstico de enfermedad priónica. El material infeccioso se inyecta directamente en el cerebro de animales de laboratorio y después de un largo periodo de incubación (8 a 12 meses aproximadamente para la EEB) los animales enferman y mueren. El examen del cerebro revela los típicos cambios espongiformes y grandes cantidades de la proteína priónica patológica. Sin embargo estos experimentos se limitan sólo a la investigación y no son adecuados para un diagnóstico de rutina.

La trasmisión experimental a animales de laboratorio es el único método establecido para la identificación y cuantificación de la infectividad y para el aislamiento y caracterización de distintas variedades del agente. El nivel de infectividad en una muestra se puede valorar por la titulación final o por el periodo de incubación. La transmisión de la enfermedad a un animal de la misma especie rinde la máxima eficiencia de infección mientras que la transmisión entre especies está dificultada por la barrera de especie, efecto no predecible pero a menudo importante, que reduce la eficiencia de la infección, disminuyendo así la sensibilidad del método y aumentando el periodo de incubación en animales efectivamente infectados. La existencia de múltiples variantes de agentes causales de scrapie y enfermedad de CJ, junto con la variedad de propiedades en diferentes animales hospedadores, complica aún más la selección de modelos animales adecuados.

Modelos animales convencionales

Se han usado ampliamente modelos no transgénicos para demostrar la transmisibilidad de las EETs humanas y animales. Así se ha transmitido regularmente el scrapie desde cabras y ovejas infectadas a ratones. En los últimos 40 años se han detectado y caracterizado más de 20 variantes de scrapie usando un panel de líneas de ratones genéticamente definidas. Los primates no humanos son las especies más susceptibles a la infección experimental con agentes de las EETs humanas. Sin embargo, incluso entre especies de primates con secuencias de genes PrP similares o idénticas, aparecen diferencias en la susceptibilidad a los agentes de las EETs humanas. Por razones éticas y de logística, varios laboratorios han intentado, y a veces conseguido, trasmitir EETs humanas a roedores, pero los estudios en primates y rumiantes, aunque caros y logísticamente difíciles, siguen siendo importantes para confirmar la relevancia de los experimentos en roedores de laboratorio más accesibles y para valorar la sensibilidad relativa de esos ensayos en roedores.

Modelos transgénicos

Desde 1989 se han desarrollado ratones transgénicos que expresan genes PrP exógenos, creándose un gran número de líneas de ratones transgénicos que portan varios genes PrP de diferentes especies susceptibles a EETs (humanos, ovinos, bovinos, etc.). En general, para lograr una transmisión eficiente con cortos periodos de incubación se ha requerido o bien la ablación del gen PrP endógeno en el ratón portador del gen transgénico, la introducción de una quimera de PrP (Ej. ratón-humano), la expresión de múltiples copias del gen transgénico o una combinación de varias de estas posibilidades. Sin embargo, un corto periodo de incubación no siempre conlleva una mayor sensibilidad. Todavía es necesario dilucidar mejor qué factores son los más importantes para desarrollar modelos de ensayos animales capaces de detectar infectividad a través de la barrera de especie con gran sensibilidad.

Recientemente se han usado los ratones transgénicos para investigar posibles tratamientos de la enfermedad. Un suceso primordial en la patogénesis de la EET es la conversión de la PrP normal de las células (PrPc) a la forma anormal (PrPsc). Los compuestos que inhiban esa transformación serían grandes candidatos a ser usados como medicamentos para la profilaxis o incluso la terapéutica.

Un modelo rápido (con corto periodo de incubación) de scrapie de hamsters en ratones transgénicos "hamsterizados" se está usando para investigar el uso de inhibidores de la formación de PrPsc como posibles agentes terapéuticos. También se han usado ampliamente los ratones transgénicos para estudiar las implicaciones de las células B, T y otros componentes del sistema inmunitario en la patogénesis del scrapie experimental de los ratones.

 

3. ENSAYOS BASADOS EN LA DETECCIÓN DE PrP ESPECÍFICO DE LA ENFERMEDAD

El distintivo de las EETs es la acumulación del PrPsc en el cerebro y en menor medida en otros tejidos. La detección del PrPsc en el tejido cerebral de individuos afectados por técnicas inmunoquímicas es rápido, sensible y proporciona resultados muy fiables. Requieren mucho menos tiempo que los ensayos de infectividad y pueden ser realizados sobre tejido fijado (inmunohistoquímica, que es relativamente rápido -días o semanas- y no es útil por lo tanto como una herramienta rápida de vigilancia de la enfermedad) o sin fijar (inmunoblotting [IB], ELISA, DELFIA, inmunoensayo dependiente de la conformación). La cantidad de PrPsc en un tejido patológico depende de la especie hospedadora, la variedad del agente infeccioso, la ruta de infección y el tiempo transcurrido desde la infección; así los inmunoensayos de PrP deberían interpretarse con un cuidado especial cuando no existen curvas de cinética de acumulación de PrPsc disponibles.

En los estadios preclínicos de la enfermedad, el PrPsc puede ser indetectable en el cerebro pero puede que sea detectado en tejidos linfoides. Las mejoras en la sensibilidad de estos métodos son fundamentales para detectar bajos niveles de PrPsc en los estadios preclínicos de la infección, analizar PrPsc en tejidos y fluidos no pertenecientes al sistema nervioso central (SNC) y para la evaluación de productos biológicos finales usados en medicina.

Una cuestión crítica en la normalización de estas técnicas es identificar y tener disponible un panel de referencia de antígenos (PrPsc purificado, PrP recombinante de diferentes especies o ambos) y anticuerpos anti-PrP.

Inmunohistoquímica

Es la detección microscópica de PrPsc teñido inmunológicamente. No solo detecta el PrPsc sino que también revela su patrón de distribución topográfica en el tejido. Resultan críticas para la sensibilidad y especificidad del método, el protocolo de fijación del tejido y los procesos adicionales para desenmascarar los sitios con capacidad antigénica del PrPsc y para eliminar el PrP normal. Estudios en ovinos con signos clínicos de scrapie y en humanos con EETs, demostraron que la inmunohistoquímica tenía una sensibilidad mayor que la histopatología clásica. En ovinos infectados con scrapie se detectó claramente PrPsc en tejidos linfoides de forma temprana en el periodo de incubación, antes de aparecer los síntomas clínicos. Esto podría servir también para la nueva variante del CJ en humanos.

Las técnicas inmunohistoquímicas de detección de PrPsc en tejidos humanos fijados con formol han sido optimizadas muy cuidadosamente y generan unos resultados muy reproducibles, pero ha aparecido un nuevo y sencillo protocolo, fijando el tejido cerebral con fijador de Carnoy en lugar de formalina y luego tratando las secciones con proteinasa K y tiocianato de guanidina antes de la tinción inmunológica que rinde unos resultados muy consistentes en la identificación de todos los tipos de depósitos de PrPsc, conservando la morfología del tejido excepcionalmente bien. Y lo que es más importante, permite una extracción posterior del PrPsc desde el material incluido en parafina para el IB u otros métodos de análisis que se realizaban generalmente en tejidos sin fijar.

El establecimiento de protocolos normalizados, (que no parece difícil, dado que hay muchos investigadores con una gran experiencia en inmunohistoquímica de EETs y han publicado varios estudios comparativos de diferentes protocolos) debería incluir la selección y el suministro de material de referencia positivo y negativo y anticuerpos específicos anti PrP. Ya hay disponibles colecciones de tejidos humanos y animales infectados, procedentes de varias fuentes, y algunos han sido titulados respecto a su infectividad.

Inmunoblotting

Antes del inmunoblotting el tejido se purifica parcialmente mediante extracciones con detergentes, centrifugación diferencial y digestiones enzimáticas. Se realiza una separación de proteínas por electroforesis en gel y se transfieren posteriormente del gel a una membrana en el inmunoblotting propiamente dicho, conservando la disposición espacial de las proteínas, para ser sometidas por último a anticuerpos mono o policlonales con el fin de demostrar la presencia del prión patológico.

La identificación de PrPsc por IB es un test altamente específico que se practica sobre tejido sin fijar o fijado con el fijador de Carnoy. El PrPsc se compone de varios tipos, de acuerdo con la masa molecular relativa (Mr) de su fragmento resistente a proteasa tras la eliminación de sus dos cadenas azucaradas. Los fragmentos de PrPsc (27-30) resistentes a proteasa pueden ser subclasificados de acuerdo con la proporción de sus tres glicoformas (PrP di-, mono- y no-gucosilado) que generalmente migran como tres bandas electroforéticas con diferentes pesos moleculares. Estos parámetros cartacterizan el así llamado "tipado de PrPsc" y pueden proporcionar información útil sobre la supuesta variedad de agente causal de EET. De momento no hay una clasificación universalmente aceptada de los subtipos humanos de PrP detectados por el Western blotting, problema que requiere una solución urgentemente.

Se ha desarrollado un IB sensible basado en el anticuerpo monoclonal 6H4 que reconoce PrP humano, bovino, ovino, porcino, de conejo y de hamster. Detecta el PrPsc en tejido cerebral bovino al poco tiempo tras el sacrificio y se le ha estimado una sensibilidad del 97% bajo condiciones de campo adversas.

Otro IB desarrollado recientemente era útil para monitorizar la distribución de PrPsc en distintas fracciones de productos medicinales obtenidos a partir de plasma.

Se ha desarrollado también un panel de anticuerpos monoclonales que reconocen diferentes regiones de la molécula de PrP en varios mamíferos, que son útiles para demostrar diferentes fragmentos de PrPsc y pueden servir en un futuro para afinar el tipado de PrP.

ELISA, DELFIA e inmunoensayo dependiente de la conformación

En ELISA y DELFIA (Disociation Enhanced Lanthanide Fluoro Immuno Assay) se liga el PrP a placas de plástico multipocillo y luego se somete a anticuerpos específicos. La detección de la proteína viene dada por una reacción colorimétrica catalizada por un enzima (ELISA) o por la resolución en el tiempo de la reacción fluorimétrica de un quelato de lantánido unido a un anticuerpo de detección primario o secundario (DELFIA). El reconocimiento de dos determinantes antigénicos del PrP con DELFIA, convierten a esta prueba en un método sensible y reproducible para la valoración de PrP en sangre y fracciones sanguíneas y puede ser desarrollado para constituir la base de un test diagnóstico de EETs.

La prueba DELFIA, está basada en las particulares propiedades de fluorescencia de quelatos de los metales del grupo de los lantánidos europio, samario, disprosio y terbio. Las propiedades de estos quelatos permiten desarrollar pruebas con una excelente relación señal/ruido que mejora su sensibilidad.
Los laboratorios Wallac (http://www.wallac.com) proporcionan un amplio abanico de productos bajo las marcas DELFIA® y LANCE™ en forma de kits o de reactivos para marcado con uno o más lantánidos en pruebas de mono o multimarcado.
Todos los reactivos DELFIA se marcan usando el quelato DELFIA N1 y son apropiados para análisis de alta sensibilidad basados en técnicas de separación como los de detección de proteínas, adhesión de células o inmunoensayos. La fluorescencia se desarrolla por la adición de una solución potenciadora.
La fluorimetría disociada en el tiempo es una gran alternativa al uso de radionúclidos en las pruebas analíticas. Permite análisis fiables y sobre todo una sensibilidad mejor que cualquier otro método no basado en radioisótopos. Esta alta sensibilidad radica en las propiedades peculiares de los quelatos de lantánidos, que permiten una distinción clara de la fluorescencia de fondo del entorno, basada en el tiempo y en la longitud de onda de su fluorescencia. La longitud de onda de la luz que emiten es unos 200-300 nm mayor que la de la luz de excitación que se usa y es única para cada fluoróforo de lantánido, con lo que al no superponerse los espectros de emisión, es muy adecuado para desarrollar pruebas en las que se utiliza más de un reactivo marcado en la misma prueba, por ejemplo dos anticuerpos monoclonales con un fluoróforo distinto cada uno, dirigidos contra dos determinantes antigénicos de la molécula que se quiere detectar.
La fluorescencia de los quelatos de lantánido dura 20-35 veces más que la de los fluoróforos convencionales y la fluorescencia disociada en el tiempo comienza sólo después de que la fluorescencia de cualquier sustancia convencional se haya extinguido.

El inmunoensayo dependiente de la conformación (CDI) ha sido desarrollado para discernir entre PrPsc y PrP en muestras sin una digestión previa con proteinasa K. Pudiera servir para definir variantes de agentes causales de EETs y para indicar el origen de la infección. Ha sido propuesto también como un método potencialmente fiable para detectar niveles de infectividad muy bajos.

Inmunoelectroforesis capilar (CIE)

Basado en la competición entre PrP y PrP sintético marcado con fluoresceína por la unión a anticuerpos específicos. Cuando el PrP está presente, compite con el péptido marcado por su unión al anticuerpo y la fluorescencia se pone de manifiesto con un detector inducido por láser. Las formas normales y anormales de PrP se distinguen sometiendo las muestras a digestión con proteinasa K antes de la extracción. Esta técnica detecta PrPsc en extractos de la capa blanco amarillenta de leucocitos y plaquetas que queda sobre la fracción roja tras sedimentar sangre sin coagular en un tubo, procedente de ovinos infectados con scrapie o de ciervos o alces infectados con la enfermedad consuntiva crónica, antes de la aparición de los primeros signos clínicos de la enfermedad.

 

4. ENSAYOS QUE NO SE BASAN EN LA DETECCIÓN DE PrP

Como el diagnóstico definitivo de la enfermedad se basa generalmente en el análisis neuropatológico y la identificación de PrPsc en tejidos postmortem, y, por otra parte, la biopsia cerebral no está indicada puesto que no existe cura y lo único que puede hacer es empeorar las condiciones del paciente, sería útil disponer de otros marcadores diagnósticos más accesibles. Se ha observado frecuentemente en pacientes de la enfermedad de CJ y con menor frecuencia en los de otras enfermedades neurológicas, niveles anormalmente altos de varias proteínas cerebrales (NSE, S-100, tau, 14-3-3) en el fluido cebroespinal. La identificación de la 14-3-3 por Western blotting parece ser el test disponible más sensible y, aunque no específico, un resultado positivo en un contexto clínico adecuado apoya el diagnóstico de una enfermedad de CJ.

 

DEFINICIONES

Fijador de Carnoy:

6 partes de etanol anhidro (desnaturalizador de proteínas y ADN)
3 partes de ácido acético glacial (desnaturalizador de ADN)
1 parte de cloroformo (favorecedor de la penetración en tejidos ricos en lípidos)

Buena mezcla por su rapidez de acción y puesta en evidencia del núcleo celular para fijar organismos para la investigación genética. Los organismos pueden ser almacenados durante varios meses o años a temperatura ambiente.

JEAN-BAPTISTE CARNOY: conocido en histología por su fijador anhidro. Eclesiástico, botánico, pedagogo e investigador, nació en Rumillies (Bélgica) en 1836 y murió en Schuls (Suiza) en 1899. Inhumado en el cementerio de Rumillies (Bélgica). Estudió botánica en la universidad de Lovaina. Doctor en ciencias naturales, viajó a Bonn con una ayuda de su gobierno y en Gena conoció a Carl Zeiss. Se interesó por la óptica y gozó de una relación privilegiada con él durante toda su carrera. Fundó en 1884 la revista internacional ilustrada "La Célula", de planchas litográficas, más tarde de dibujos y fotografías en los campos de la botánica y la zoología. Dejó de publicarse en 1987. La biblioteca del instituto Pasteur posee la colección de 1889 a 1969.

Blotting:

Del inglés "blot" ( mancha, borrón, manchar). Término general para la transferencia de moléculas de proteínas, ARN o ADN desde un gel de acrilamida o agarosa relativamente espeso a un papel a modo de membrana, (generalmente nylon o nitrocelulosa) por capilaridad o un campo eléctrico, conservando la disposición espacial. Una vez en la membrana, las moléculas se inmovilizan por calentamiento o rayos ultravioleta y pueden ser detectadas luego con gran sensibilidad por hibridación (en el caso del ADN y ARN) o por anticuerpos (en el caso de las proteínas).

Los "blots" de ARN se llaman "Northern blots", los de ADN "Southern blots" y los de proteínas "Western blots" (Western blotting).

La razón para transferir proteínas desde geles a membranas es para hacerlas más accesibles a distintas pruebas, ya que la poliacrilamida no es muy adecuada para la difusión de grandes moléculas. El tipo más común de prueba al que se someten esas proteínas inmovilizadas es un anticuerpo y el complejo antígeno-anticuerpo se visualiza por enzimoinmunoensayo indirecto usando un sustrato cromogénico que genera un producto insoluble. Últimamente se ha empezado a usar la quimioluminiscencia por su mayor sensibilidad de detección. Otras posibilidades son los marcadores fluorescentes o los radioisótopos. El interés de la técnica radica en la detección de una proteína específica simultáneamente por su antigenicidad y su masa molecular: se separan primero las proteínas por su masa en la electroforesis y luego se detectan específicamente en el inmunoensayo.

Inmunoblotting:

Cantidades muy pequeñas de proteínas son transferidas desde geles a hojas de nitrocelulosa por electroforesis y luego detectadas por su unión a anticuerpos, generalmente combinados con peroxidasa o IgG marcada radiactivamente. Una técnica exacta para el reconocimiento específico de cantidades muy pequeñas de proteínas.

 

TEST DISPONIBLES

La Unión Europea realizó una evaluación de los test diagnósticos de EETs para obtener información concluyente sobre el rendimiento (sensibilidad y especificidad) de los test disponibles o en un avanzado estado de desarrollo, evaluados con el fin de diagnosticar EEB usando cerebro de bovino infectado y controles negativos. Los resultados fueron los siguientes:

1. E.G. G. Wallac Ltd., Reino Unido - método DELFIA que es un procedimiento inmunoquímico con dos sitios antigénicos de ligamiento no competitivo, usando dos anticuerpos monoclonales distintos. Requiere menos de 24 horas para completarse. Sensibilidad de 69.8% y especificidad de 89.8%.
2. Prionics AG, Suiza - basado en el western blotting, usa el anticuerpo monoclonal 6H4. Requiere 7-8 horas y se usa para controlar el scrapie de ovejas en Suiza. Sensibilidad del 100% y especificidad del 100%
3. Enfer Ltd., Irlanda - quimioluminiscencia por ELISA usando un anticuerpo policlonal. Puede realizarse en 4 horas. Sensibilidad del 100% y especificidad del 100%
4. CEA, Francia - Inmunoensayo Sandwich usando 2 anticuerpos monoclonales que puede realizarse en menos de 24 horas. Tenía los mejores resultados en el análisis de homogeneizados diluidos. Sensibilidad del 100% y especificidad del 100% (Comisión Europea, 8 de julio de 1999)

Prionics Inc. una compañía surgida en 1997 al abrigo de la Universidad de Zürich, fundada por tres científicos, con el propósito de la investigación en el área de la medicina biológica, especializándose en el campo de las enfermedades priónicas y en el desarrollo y explotación de test diagnósticos, ha creado el test comercial "prionics-check" que parece más desarrollado que el resto de sus posibles competidores.

Es un inmunoblotting basado en un procedimiento de westernblotting para la detección del fragmento PrPsc (denominado PrP 27-30) resistente a proteasa, usando el anticuerpo monoclonal 6H4. El método puede resumirse brevemente como sigue: se toma un trozo de tejido del tronco cerebral o de la médula cervical de unos 5 gramos y se homogeiniza utilizando materiales plásticos desechables para evitar contaminaciones cruzadas entre las muestras. Se somete el homogeneizado a digestión con proteinasa K, se lleva a ebullición en una solución tampón con dodecil sulfato sódico y se pasa luego a un gel de poliacrilamida. Tras la separación electroforética se trasfieren las proteínas a una membrana y se detecta la PrP 27-30 con el anticuerpo 6H4 y una reacción de quimioluminiscencia. Más abajo se muestran ejemplos de reacciones positivas y negativas. El tiempo mínimo para completar el test es de unas siete a ocho horas. El proceso de registro de las muestras está automatizado con un programa de base de tatos específico, que utiliza códigos de barras y permite la trazabilidad de la muestra a lo largo de todo el proceso. Las muestras se colocan y procesan en placas de 96 pocillos y se pasan a los geles usando pipetas multicanal de acuerdo con un protocolo estandarizado. Al final se lee el resultado de la membrana y se introduce en la base de datos. Se pueden registrar detalles particulares de cada muestra que permitan luego una búsqueda fácil de determinadas muestras o animales. El test no proporciona una lectura cuantitativa, aunque la intensidad de la respuesta puede ser cuantificada con un sistema apropiado, la respuesta es cualitativa y se basa en dos criterios, (1) la presencia de la señal y (2) su posición; lo que permite una fácil discriminación entre los verdaderos positivos y los (potencialmente) falsos positivos debido a la presencia de proteína PrP normal que no haya sufrido digestión.

Fotografía del test Prionics donde se puede ver la muestra de control en el extremo izquierdo y dos muestras positivas. Las otras líneas corresponden a muestras negativas.

La primera vaca positiva a EEB nacida en Alemania fue sacrificada el 22 de noviembre de 2000 en un matadero del norte de Alemania, conducida al matadero como un sacrificio normal y chequeada en un programa privado de monitorización ofrecido por los laboratorios "Prionics" a lo largo de Alemania. Resultó positiva al test esa misma tarde del 22 de noviembre en un laboratorio de Hamburgo y posteriormente confirmada como positiva en el centro de referencia alemán de EEB en Tübingen.

La compañía fabricante del Prionics-Check proporciona la siguiente información sobre el producto:

Prionics-Check

Test inmunológico para la detección de priones en tejido de cerebro y médula espinal, principalmente usado para el diagnóstico de EEB y scrapie, disponible como un kit con los reactivos esenciales para el test. Basado en la técnica del Western blotting, el tejido cerebral de los animales sacrificados se extrae, se licua y se examina para detectar la presencia de PrPsc. El resultado está disponible en unas 6 a 7 horas tras la llegada de la muestra al laboratorio. Puede detectar la presencia de acúmulos de PrPsc en el cerebro antes de que el animal muestre los primeros síntomas de EEB y su fiabilidad es la misma que la del anterior método de referencia (inmunohistoquímica) pero los resultados se consigue en un tiempo mucho menor y con menos gastos. De acuerdo con los conocimientos actuales, la acumulación de PrPsc en el cerebro del ganado comienza al menos 6 meses antes de que aparezcan los síntomas típicos de la EEB. El test, así, permite una detección temprana y realiza una contribución significativa a la reducción del riesgo de transmitir patógenos de EEB al ser humano a través de la cadena alimentaria.

Las principales aplicaciones del test son:

· Clarificación rápida de los casos sospechosos de EEB
· Diagnóstico en el proceso de matanza para el reconocimiento y eliminación de casos subclínicos de EEB en animales.
· Monitorización de EEB y scrapie.

 

REFERENCIAS

El texto ha sido elaborado consultando los siguientes documentos.

• Organización Mundial de la Salud: WHO Consultation on Diagnostic Procedures for Transmissible Spongiform Encephalopathies, Need for Reference Reagents and Reference Panels. Geneva, Switzerland. 22-23 March 1999 (http://www.who.org)

• Review on the Current Diagnosis of Scrapie. Linda A. Detwiler, DVM. United States Department of Agriculture. Animal and Plant Health Inspection Service, U.S.A. (http://www.iica.org.ar/BSE/)

• Diccionario médico en Internet: http://www.graylab.ac.uk/cgi-bin/omd?action=Home&query=

• DELFIA, laboratorios Wallac (http://www.wallac.com)

• Test Prionics-Check. Laboratorios Prionics. (http://www.prionics.com)

• Enzyme-Assisted Immunoelectroblotting (IEB Or Western Blotting) E.P. Rybicki and Maud Purves. Department of Microbiology, University of Cape Town, 1996 http://www.uct.ac.za/microbiology/western.html

• (http://www.protocol-online.net/molbio/Protein/western.htm)

• The evaluation of tests for the diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy in bovines (8 July 1999). EUROPEAN COMMISSION. DIRECTORATE-GENERAL XXIV. CONSUMER POLICY AND CONSUMER HEALTH PROTECTION. Directorate B - Scientific Health Opinions. (http://europa.eu.int/comm/food/fs/bse/bse12_en.html)

• Jean-Baptiste Carnoy, Une Bibliographie. INSTITUT PASTEUR, BIBLIOTHÈQUE (http://www.pasteur.fr/infosci/biblio/bibliogr/carnoy.html)

SIVELE, Sindicato de Veterinarios de León, diciembre de 2000.

 

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